四環(huán)素類檢測試劑盒使用說明書（酶聯(lián)免疫法）
 
1 原理及用途
本試劑盒采用間接競爭ELISA方法檢測組織、蜂蜜、雞蛋等樣本中的四環(huán)素類藥物（Tetracyclines，TCs），試劑盒由預(yù)包被偶聯(lián)抗原的酶標(biāo)板、辣根酶標(biāo)記物、抗體、標(biāo)準(zhǔn)品及其他配套試劑組成。檢測時，加入標(biāo)準(zhǔn)品或樣品溶液，樣本中的四環(huán)素類藥物和酶標(biāo)板上預(yù)包被偶聯(lián)抗原競爭抗四環(huán)素類藥物抗體，加入酶標(biāo)記物后，用TMB底物顯色，樣本吸光度值與其所含四環(huán)素類藥物含量成負(fù)相關(guān)，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較即可得出樣本中四環(huán)素類藥物的殘留量。
2 四環(huán)素類檢測試劑盒技術(shù)指標(biāo)
2.1 試劑盒靈敏度：0.05ppb(ng/ml)
2.2 反應(yīng)模式：37℃，30min～30min～15min
2.3 檢測下限：
組織、肝臟、雞蛋………………0.3ppb
蜂蜜………………………………2ppb
尿樣………………………………0.5ppb
2.4 交叉反應(yīng)率：
四環(huán)素………………………………100%
二甲胺四環(huán)素………………………125%
吡四環(huán)素……………………………110%
金霉素………………………………100%
脫甲基金霉素………………………35%
土霉素………………………………58%
強力霉素……………………………45%
 2.5 樣本回收率：
組織、肝臟、雞蛋…………85±20%
蜂蜜…………………………75±20%
尿樣…………………………80±20%
3 試劑盒組成
酶標(biāo)板………………………96孔
標(biāo)準(zhǔn)品（黑蓋）：各1ml
0ppb、0.5ppb、1.5ppb、4.5ppb、13.5ppb、40.5ppb
高標(biāo)準(zhǔn)品（黑蓋）：1ppm…………1ml
酶標(biāo)記物（紅蓋）…………………11ml
抗體工作液（藍(lán)蓋）………………5.5ml
底物液A（白蓋）……………………6ml
底物液B（黑蓋）……………………6ml
終止液（黃蓋）………………………6ml
20X濃縮洗滌液（白蓋）……………40ml
5X復(fù)溶液（黃蓋）…………………50ml
說明書………………………………1份
4 需要的器材和試劑
4.1 儀器：酶標(biāo)儀、打印機、均質(zhì)器 、氮氣吹干裝置、振蕩器、離心機、刻度移液管、天平（感量0.01g）
4.2 微量移液器：單道20µl-200µl，100µl-1000µl、多道300µl
4.3 試劑：三酸、甲醇
5 樣本前處理
5.1 樣本處理前須知：
實驗器具必須潔凈并使用一次性吸頭，以避免污染干擾實驗結(jié)果。
5.2 配液：
配液1：1%三酸溶液
    稱取1g三酸加去離子水100ml溶解。
配液2：復(fù)溶液
    將5×復(fù)溶液用去離子水5倍稀釋，用于樣本的復(fù)溶，復(fù)溶液在4℃環(huán)境可保存一個月。
5.3 樣本前處理步驟：
5.3.1 組織、肝臟、雞蛋樣本處理方法（不用過柱）
1）用均質(zhì)器均質(zhì)組織、肝臟、雞蛋樣本；
2）稱取2±0.05g樣本于50ml離心管中，加入6ml 1%三酸溶液，振蕩2min，室溫4000r/min以上，離心10min；
3）取出1ml上清液于另一試管中，加入1m甲醇，振蕩1min，室溫4000r/min以上，離心10min；
4）取1ml上清液在50-60℃氮氣或空氣吹干，加入1ml復(fù)溶液溶解殘留的干燥物；
5）取50 µl用于分析。
    樣本稀釋倍數(shù)：6    檢測下限：0.3ppb
5.3.2 蜂蜜樣本處理方法
1）準(zhǔn)確稱取1±0.05g蜂蜜樣本于離心管中，加入2ml 1%三酸，振蕩2min，室溫4000r/min以上，離心10min；
2）取出100ul上清液于另一試管中，加入1900ul復(fù)溶液稀釋，混合30s；
3）取50µl用于分析。
    樣本稀釋倍數(shù)：40    檢測下限：2ppb
5.3.3 尿樣本的處理方法
1）用復(fù)溶液將尿樣10倍稀釋（如果尿樣渾濁一定要過濾或離心10min，4000r/min，直至得到清亮尿樣），暫不使用的樣本應(yīng)冷凍保存。
2）取50µl稀釋的尿樣用于分析。
    樣本稀釋倍數(shù)：10    檢測下限：0.5ppb
6 酶聯(lián)免疫試驗步驟
    將所需試劑從4℃冷藏環(huán)境中取出，置于室溫平衡30min以上, 洗滌液冷藏時可能會有結(jié)晶需恢復(fù)到室溫以充分溶解，每種液體試劑使用前均須搖勻。取出需要數(shù)量的微孔板及框架，將不用的微孔板放入自封袋，保存于2-8℃。
實驗開始前，用去離子水將20×濃縮洗滌液按20倍稀釋成工作洗滌液。
制備四環(huán)素標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液：將各濃度標(biāo)準(zhǔn)品分別用稀釋好的復(fù)溶液10倍稀釋成應(yīng)用液，現(xiàn)配 現(xiàn)用。（如：分別取50ul各濃度標(biāo)準(zhǔn)品加450ul稀釋好的復(fù)溶液，混合均勻，即成各濃度標(biāo)準(zhǔn)品的應(yīng)用液。）
6.1 編    號：將樣本和標(biāo)準(zhǔn)品對應(yīng)微孔按序編號，每個樣本和標(biāo)準(zhǔn)品做2孔平行，并記錄標(biāo)準(zhǔn)孔和樣本孔所在的位置。
6.2 加樣反應(yīng)：加標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)用液或樣本50µl/孔到各自的微孔中，然后加抗體工作液50µl/孔，輕輕振蕩5秒混勻，37℃避光反應(yīng)30分鐘。
6.3 洗    滌：將孔內(nèi)液體甩干，用工作洗滌液250µl/孔充分洗滌5次，每次間隔30秒，zui后用吸水紙拍干（拍干后未被清除的氣泡可用干凈的槍頭刺破）。
6.4 加酶反應(yīng)：加酶標(biāo)記物100µl/孔，37℃避光反應(yīng)30分鐘。
6.5 洗    滌：同上
6.6 顯    色：加底物液A 50µl/孔，再加底物液B 50µl/孔，輕輕振蕩5秒混勻，37℃避光顯色15分鐘。
6.7 終    止：加終止液50µl/孔，輕輕振蕩混勻，終止反應(yīng)。
6.8 測吸光值：用酶標(biāo)儀于450nm處測定每孔吸光度值（建議用雙波長450/630nm）。測定應(yīng)在終止反應(yīng)后10分鐘內(nèi)完成。
7 結(jié)果分析
7.1 百分吸光率的計算
    標(biāo)準(zhǔn)液或樣本的百分吸光率等于標(biāo)準(zhǔn)液或樣本的百分吸光度值的平均值（雙孔）除以*個標(biāo)準(zhǔn)液（0ppb）的吸光度值，再乘以100%，即
 百分吸光度值（%）＝
A
×100%
A0
A—標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣本溶液的平均吸光度值
A0—0ppb標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均吸光度值
7.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制與計算
    以標(biāo)準(zhǔn)液百分吸光率為縱坐標(biāo)，對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)液濃度（ppb）的對數(shù)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)液的半對數(shù)曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出樣本所對應(yīng)的濃度，乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中待測物的實際濃度。
    若利用試劑盒專業(yè)分析軟件進(jìn)行計算，更便于大量樣本的準(zhǔn)確、快速分析。（索?。?br />8 注意事項
8.1 室溫低于25℃或試劑及樣本沒有回到室溫（25℃）會導(dǎo)致所有標(biāo)準(zhǔn)的OD值偏低。
8.2 在洗板過程中如果出現(xiàn)板孔干燥的情況，則會出現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線不成線性，重復(fù)性不好的現(xiàn)象。所以洗板拍干后應(yīng)立即進(jìn)行下一步操作。
8.3 混合要均勻，洗板要*，在ELISA分析中的再現(xiàn)性，很大程度上取決于洗板的*性。
8.4 在所有孵育過程中，用蓋板膜封住微孔板，避免光線照射。
8.5 不要使用過了有效期的試劑盒，不要交換使用不同批號試劑盒中的試劑。
8.6 顯色液若有任何顏色表明變質(zhì)，應(yīng)當(dāng)棄之。0標(biāo)準(zhǔn)的吸光度值小于0.5個單位（A450nm< 0.5 ）時，表示試劑可能變質(zhì)。
8.7 反應(yīng)終止液有腐蝕性，避免接觸皮膚。
9 貯藏及保存期
儲藏條件：試劑盒于2-8℃保存，避免冷凍。
保 質(zhì) 期：該產(chǎn)品有效期為1年，生產(chǎn)日期見包裝盒。